2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

动物细胞/组织

1、 使用方便。
2、 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
3、 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
4、 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性。

WB,IP等

1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

使用注意事项：
 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
 最好使用标准Dounce匀浆器匀浆，如果没有标准Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是线粒体膜蛋白回收率可能会下降。
 最好用新鲜的细胞/组织样本，也可以用冻存的细胞/组织样本，但是线粒体膜蛋白回收率会下降。
 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
 提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
 膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。



细胞样本：
1. 提取液准备：
每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每200 μl冷的试剂D中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。贴壁细胞胰酶消化或直接刮下进行相应洗涤即可。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 加入400 μl冷的试剂 A，置4℃条件下持续轻微振荡5-15分钟。用Dounce匀浆器充分匀浆20-30次。
5. 然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。
7. 在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。弃上清，留沉淀。
8. 在沉淀中加入200 μl冷的试剂B，混匀。
9. 在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。弃上清，留沉淀。
10. 在沉淀中加入200 μl冷的试剂C，高速涡旋振荡15秒，置4℃条件下持续轻微振荡15-30分钟。
11. 在37℃水浴/气浴10分钟。
12. 在37℃条件下1000-2000×g离心5分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层约为20-40 μl。
13. 小心吸取上层丢弃，留下下层溶液。
14. 用50-100 μl冰冷的膜蛋白溶解液溶解下层，即得线粒体膜蛋白。
15. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

组织样本：
1. 提取液准备：
每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每200 μl冷的试剂D中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取100 mg左右的组织样本，用手术剪刀将组织尽可能剪碎，用PBS缓冲液或生理盐水洗涤干净。
3. 加入适量PBS（或400 μl冷的试剂A），用Dounce匀浆器充分匀浆20-30次。
4. 然后将匀浆液在4℃，500×g条件下离心5分钟。
5. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
6. 将上清在4℃，1000×g条件下离心10分钟，弃沉淀，收集上清。
7. 在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。弃上清，收集沉淀。
8. 在沉淀中加入200 μl冷的试剂B，充分混匀。
9. 在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。弃上清，收集沉淀。
10. 在沉淀中加入200 μl冷的试剂C，高速涡旋混匀5秒，置4℃条件下持续轻微振荡20-30分钟。
11. 在37℃水浴/气浴10分钟。
12. 在37℃下1000×g离心5分钟，此时溶液分为两层，下层约为20-40 μl。
13. 小心吸取移除上层，留下下层。
14. 用50-100 μl冰冷的膜蛋白溶解液溶解下层，即得线粒体膜蛋白。
15. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

1.蛋白浓度低？
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A和试剂C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
线粒体膜蛋白丰度较低，在条件允许的情况下，需要尽可能的加大细胞样本的上样量，才能收获足够的膜蛋白。

2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂D中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

4.膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
电泳时最好采用低电压低电流电泳。
膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。

1.Tianhui Pan, et al.
ANKRD22, a novel tumor microenvironment-induced mitochondrial protein promotes metabolic reprogramming of colorectal cancer cells
Theranostics 2020 （IF=8.579）