2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

植物

 使用方便。 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP等

1.离心机2.振荡器3.匀浆机/匀浆器4.涡旋混匀器5.移液器6.冰箱7.冰盒

1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）2.蛋白定量试剂盒

1.离心管2.吸头3.一次性手套

1.预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。 2.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 3.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 4.蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。 5.可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。 6.最好使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，也可用普通玻璃匀浆器匀浆，但是内质网蛋白回收率会下降。 7.提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。 8.膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。 9.膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。

1. 提取液制备：每500 μl冷的蛋白提取液C中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。 提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。2. 取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的200-500 mg植物叶片组织样本用手术剪刀尽可能剪碎。【注】： 匀浆尽可能充分。至无明显可见固体。 培养细胞直接收集细胞后用Dounce匀浆器匀浆即可，匀浆后加提取液A混匀后直接进 行以下步骤离心。 处理叶片等组织样本如果没有匀浆机，也可先加少量提取液A后用Dounce匀浆器充分匀浆后再加提取液A混匀。 也可用锋利的刀片将叶片样本切成尽可能小的小方块（1-2 mm）。3. 加入500 μl-1 ml 提取液A后用匀浆机充分匀浆或者用Dounce匀浆器充分匀浆。4. 将匀浆用100 μm细胞筛过滤。【注】： 液体量少时可以加入1-2 ml PBS混匀后再用细胞筛过滤。 没有细胞筛时可以不过滤，将匀浆液在4℃静置1分钟，待大的粗纤维，成团组织块等没有破碎的组织块自然沉降，吸取上清。或者以低于100g力条件下离心1分钟，收集细胞上清，弃组织沉淀。 部分黏液较多的植物样本可能难以吸取，可以将1 ml吸头的口剪掉一点再吸。5. 将滤液在200×g条件下离心3分钟，弃沉淀，收集上清。6. 在500×g条件下离心5分钟，弃沉淀，收集上清。7. 在1000×g条件下离心10分钟，弃沉淀，收集上清。8. 将上清20000×g力离心10分钟。弃沉淀，取上清。9. 将上清30000×g -50000×g离心45分钟。弃上清，留沉淀。【注】： 如果条件允许，可将离心力加大到100000×g，有利于提高内质网小泡回收率。 如果用大的离心转头，液体量太少不好离心的话，可以添加PBS增加液体量。10. 在沉淀中加入400 μl冷的试剂B，充分混匀。11. 在4℃，30000×g -50000×g力条件下离心45分钟。弃上清，留沉淀。【注】： 如果条件允许，可将离心力加大到100000×g，有利于提高内质网小泡回收率。 如果用大的离心转头，液体量太少不好离心的话，可以添加PBS增加液体量。12. 在沉淀中加入300-500 μl提取液C，充分混匀后，在2-8℃条件下振荡30分钟-1小时。【注】： 此步骤必须在2-8℃条件振荡。 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有2-8℃振荡条件也可以不振荡，置2-8℃静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔15分钟用移液器吹打混匀即可。13. 在4℃，12000×g条件下离心10分钟。取上清。14. 在37℃水浴/气浴10分钟。15. 在37℃ 1000×g离心15分钟。【注】： 此步骤必须在37℃条件下离心。16. 此时溶液分为两层，小心移除上层，保留下层溶液，大约30-50 μl液体。17. 用30-100 μl膜蛋白溶解液溶解下层溶液，即得内质网膜蛋白。【注】： 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。 静置直至管底透明粘稠状物完全溶解。18. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

1.蛋白浓度低？ 植物内质网膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，尽可能增加组织样本量。处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当增加匀浆次数，并适当延长试剂B和C、D的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。 2.细胞裂解速度慢？ 为了充分保证提取得到的蛋白的活性，提取液采用独特的保护蛋白的配方，裂解能力温和，下游应用范围广。适当延长裂解的时间即可。 3.用什么方法定量蛋白？ 建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。 4.提取的蛋白具有活性吗？ 本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。 5.膜蛋白电泳没有条带？ 膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。电泳时最好采用低电压低电流电泳。

1.Xiao Jiang et al. Overexpression of augmenter of liver regeneration (ALR) mitigates the effect of H2O2-induced endoplasmic reticulum stress in renal tubule epithelial cellsApoptosis 2019 Ming Li et al.Network Pharmacology-Based Prediction and Verification of Qingluo Tongbi Formula to Reduce Liver Toxicity of Tripterygium wilfordii via UGT2B7 in Endoplasmic ReticulumMed Sci Monit 2020