2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

植物

 使用方便。 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP等

1.离心机2.振荡器3.匀浆机/匀浆器4.涡旋混匀器5.移液器6.冰箱7.冰盒

1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）2.蛋白定量试剂盒

1.离心管2.吸头3.一次性手套

1.预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。 2.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 3.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 4.蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。 5.可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

1. 提取液制备：每300 μl提取液D中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。2. 取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的200-500 mg植物组织样本用手术剪刀尽可能剪碎。【注】： 也可用锋利的刀片将叶片样本切成尽可能小的小方块（1-2 mm）。3. 加入500 μl试剂A，充分混匀。【注】： 可以将叶片组织在液氮中冷冻后稍微捣碎成细的粉末后再加入试剂A。4. 在30℃条件下静置15分钟。5. 在2000×g条件下离心10分钟，弃上清，收集沉淀。6. 在沉淀中加入0.5 ml提取液B，充分混匀。【注】： 培养细胞1000×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞后用PBS洗涤2次，然后直接加入提取液B重悬。 大约每300 μl细胞沉淀体积中加入1 ml提取液B。 根据实际样本体积调整提取液用量，一般试剂是样本体积的2-3倍，充分淹没样本即可。7. 将提取液B样本悬液置振荡器37℃-45℃或室温振荡24小时。【注】： 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有振荡条件也可以不振荡，中间每隔几小时用移液器吹打混匀即可。 根据下游内质网的应用选择合适的温度，最高温度为55℃时制备速度最快。但是温度过高会影响样本活性，请根据下游应用选择温度。 不同类型的植物样本需要处理的时间差异较大。拟南芥较易处理，鲜嫩叶片较易处理，年龄小的样本处理时间短。拟南芥嫩叶最短4小时即可。 部分细胞壁较厚的植物类型可能需要处理更长时间。可以延长至72小时以上处理以提高得率。8. 在2000×g离心10分钟，弃上清，收集沉淀。【注】： 有条件的话最好用100 um细胞筛网过滤提取液B处理液后，收集滤液再离心。 没有细胞筛可以不过滤。9. 在沉淀中加入1000 μl试剂C重悬沉淀，充分混匀。10. 用匀浆机充分匀浆或者用Dounce匀浆器充分匀浆。【注】： 一般用Dounce匀浆器的匀浆30-40次。 每上下一个来回为一次。11. 将匀浆液置4℃振荡20-30分钟。【注】： 用振荡器/摇床的较低转速，保持液体稍微有晃动即可。 没有低温振荡条件可以不振荡，在2-8℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。12. 在500×g条件下离心5分钟，弃沉淀，收集上清。13. 在1000×g条件下离心10分钟，弃沉淀，收集上清。14. 将上清20000×g力离心10分钟。弃沉淀，取上清。15. 将上清30000-50000×g离心45分钟。弃上清，留沉淀。【注】： 如果条件允许，可将离心力加大到100000×g，有利于回收所有光面内质网小泡。16. 在沉淀中加入100-300 μl提取液D，充分混匀。17. 置振荡器2-8℃振荡30分钟。【注】： 用振荡器/摇床的较低转速，保持液体有轻微晃动即可。 没有低温振荡条件可以不振荡，在2-8℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。18. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。19. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到内质网蛋白。20. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

1.蛋白浓度低？植物内质网蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，尽可能增加样本量。处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当增加匀浆次数，并适当延长试剂B和C、D的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。 2.用什么方法定量蛋白？ 建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂C中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。 提取的蛋白具有活性吗？本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

1.Xiao Jiang et al. Overexpression of augmenter of liver regeneration (ALR) mitigates the effect of H2O2-induced endoplasmic reticulum stress in renal tubule epithelial cellsApoptosis 2019 2.Ming Li et al.Network Pharmacology-Based Prediction and Verification of Qingluo Tongbi Formula to Reduce Liver Toxicity of Tripterygium wilfordii via UGT2B7 in Endoplasmic ReticulumMed Sci Monit 2020