高尔基体蛋白提取试剂盒（蛋白相互作用适用（pull-down、co-IP等））

BB-314533
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产品概述 product description

贝博® BBproExtra® 高尔基体蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种动物细胞和实体软、硬组织样本的高尔基体提取。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。 高尔基体（Golgi apparatus, Golgi bodies）是由许多扁平的囊泡构成的以分泌为主要功能的细胞器。又称高尔基器或高尔基复合体；高尔基体是由数个扁平囊泡堆在一起形成的高度有极性的细胞器。常分布于内质网与细胞膜之间，呈弓形或半球形，凸出的一面对着内质网称为形成面（forming face）或顺面（cis face）。凹进的一面对着质膜称为成熟面（mature face）或反面（trans face）。顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡，在具有极性的细胞中，高尔基体常大量分布于分泌端的细胞质中。因其看上极像滑面内质网，因此有科学家认为它是由滑面内质网进化而来的。 高尔基体中的酶主要有糖基转移酶、磺基-糖基转移酶、氧化还原酶、磷酸酶、蛋白激酶、甘露糖苷酶、转移酶和磷脂酶等不同的类型。高尔基体的主要功能将内质网合成的蛋白质进行加工、对比分类、与包装，然后分门别类地送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。 本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。 本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。 本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。 本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用贝博其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（相关产品BB-38113）。 贝博® BBproExtra® 可以提供各种蛋白质提取、裂解、酶活测定、细胞器分离、免疫组织化学、蛋白表达、蛋白标记等蛋白质相关试剂盒产品。 贝博® BBproExtra® 可以提供针对动物细胞、组织、植物、真菌、酵母、微生物、藻类、液体、土壤等各种不同样本的蛋白提取试剂盒。 贝博® BBproExtra® 可以提供针对细胞膜、核、胞质、线粒体、溶酶体、高尔基体、内质网、外泌体等细胞不同部位的蛋白提取试剂盒。 贝博® BBproExtra® 可以提供针对下游实验不同应用的试剂盒，例如用于Western Blotting和双向电泳等不同下游应用的试剂盒；含去垢剂成分和不含去污剂成分的蛋白提取试剂盒；专用于蛋白质谱检测、Pull-down实验的试剂盒等总计300多种蛋白提取试剂盒供选择使用。 贝博® BBproExtra® 可以提供针对动物、植物等不同样本的细胞核、线粒体、溶酶体、叶绿体、外泌体等不同细胞器的提取试剂盒。 贝博® BBproExtra® 可以提供蛋白浓缩、脱盐、沉淀、透析、定量、电泳、纯化、检测等不同蛋白样品处理检测等相关试剂盒。

保存温度
2-8℃
注意事项
1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
一年
检测方法
pull-down、co-IP等
适用样本
动物细胞
产品应用
pull-down、co-IP等
仪器准备
1.离心机2.振荡器3.匀浆机/匀浆器4.涡旋混匀器5.移液器6.冰箱7.冰盒
试剂准备
1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）2.蛋白定量试剂盒
耗材准备
1.离心管2.吸头3.一次性手套
使用注意事项
1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 4.最好使用标准Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是蛋白回收率会下降。 5.离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如: 转速为3000rpm，有效离心半径为10 cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。
使用方法
细胞高尔基体提取：1. 提取液准备：每500 μl冷的蛋白提取液D中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。 以下步骤使用的提取液D为本步骤配制好的提取液D工作液。2. 取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。3. 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。4. 加入400 μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。5. 用Dounce匀浆器充分匀浆几分钟，然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。6. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。7. 在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。8. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。9. 在上清中加入10 μl试剂WT，在4℃，20000×g力条件下离心20分钟。10. 弃上清，在沉淀中加入500 μl冷的试剂B，混匀。11. 在4℃，20000×g力条件下离心30分钟。弃上清，收集沉淀。12. 在沉淀中加入100-300 μl蛋白提取液D工作液，吹打混匀后，在4℃条件下振荡15-30分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。【注】： 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。13. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。14. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到高尔基体蛋白样品。15. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。组织高尔基体提取：1. 提取液准备：每500 μl冷的蛋白提取液D中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。 以下步骤使用的提取液D为本步骤配制好的提取液D工作液。2. 取50-100 mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。3. 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。 4. 加入400 μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。5. 用Dounce匀浆器充分匀浆几分钟，然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。6. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。7. 在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。8. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。9. 在上清中加入10 μl试剂WT，在4℃，20000×g力条件下离心20分钟。10. 弃上清，在沉淀中加入500 μl冷的试剂B，混匀。11. 在4℃，20000×g力条件下离心30分钟。弃上清，收集沉淀。12. 弃上清，沉淀用高尔基体保存液重悬。13. 在沉淀中加入100-300 μl蛋白提取液D工作液，吹打混匀后，在4℃条件下振荡15-30分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。【注】： 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。14. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。15. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到高尔基体蛋白样品。16. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
常见问题分析
1.用什么方法定量蛋白？ 建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。 2.提取的蛋白具有活性吗？ 本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
参考文献
1.Jialin He et al. Olfactory Mucosa Mesenchymal Stem Cells Alleviate Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury Via Golgi Apparatus Secretory Pathway Ca2+ -ATPase Isoform1Frontiers in Cell and Developmental Biology 2020 （IF=6.684）

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