2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

动物细胞/组织

WB,IP等

1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

使用注意事项：
 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
 蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
 下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。

细胞高尔基体提取：
1. 提取液准备：
每500 μl冷的蛋白提取液D中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 加入400μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。
5. 用Dounce匀浆器充分匀浆几分钟，然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。
6. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
7. 在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。
8. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
9. 在上清中加入10 μl试剂WT，在4℃，20000×g力条件下离心20分钟。
10. 弃上清，在沉淀中加入500μl冷的试剂B，混匀。
11. 在4℃，20000×g力条件下离心30分钟。弃上清，收集沉淀。
12. 在沉淀中加入100-300 μl蛋白提取液D，吹打混匀后，在4℃条件下振荡15-20分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。
13. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
14. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到高尔基体蛋白样品。
15. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

组织高尔基体提取：
1. 提取液准备：
每500 μl冷的蛋白提取液D中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取50-100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。
3. 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
4. 加入400μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。
5. 用Dounce匀浆器充分匀浆几分钟，然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。
6. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
7. 在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。
8. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
9. 在上清中加入10 μl试剂WT，在4℃，20000×g力条件下离心20分钟。
10. 弃上清，在沉淀中加入500μl冷的试剂B，混匀。
11. 在4℃，20000×g力条件下离心30分钟。弃上清，收集沉淀。
12. 弃上清，沉淀用高尔基体保存液重悬。
13. 在沉淀中加入100-300 μl蛋白提取液D，吹打混匀后，在4℃条件下振荡15-20分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。
14. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
15. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到高尔基体蛋白样品。
16. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

1.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

2.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。