2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

细胞

 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。 提取过程简单方便。 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。 总蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP等

1.离心机2.振荡器3.匀浆机/匀浆器4.涡旋混匀器5.移液器6.冰箱7.冰盒

1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）2.蛋白定量试剂盒

1.离心管2.吸头3.一次性手套

1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 2.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 3.最好使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是溶酶体蛋白回收率会下降。 4.若实验室离心机较小达不到20000×g离心力，或者离心管质量不能承受20000×g离心力，请使用能达到的最大离心力。 5.用Dounce匀浆器匀浆是溶酶体膜蛋白提取的关键的步骤，故匀浆前最好先通过预实验确定不同组织样本的最适匀浆次数，方法是每匀浆 5-10 次后，取 2-3 μl 匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到 20%以下为佳。此镜检步骤非必须步骤，但是会影响溶酶体膜蛋白的回收率。在样本极难获取的实验中，务必做镜检。 6.提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。 7.膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。 8.膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。

提取液准备：每200 μl冷的膜蛋白提取液C中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备 用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。溶酶体蛋白提取：1. 取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞； 2. 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。【注】： 新鲜动物组织样本取50-100 mg，用PBS洗涤干净。用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。然后进行下续步骤。3. 加入500 μl-1000 μl冷的试剂 A，置冰上振荡10分钟。4. 用Dounce匀浆器匀浆30-40下。5. 在4℃，1000×g力条件下离心5分钟，弃沉淀，留上清。6. 将上清在4℃，4000×g力条件下离心10分钟，弃沉淀，留上清。7. 将上清在4℃，20000×g力条件下离心20分钟，弃上清，留沉淀。8. 在沉淀中加入500 μl冷的试剂B，混匀。9. 在4℃，20000×g力条件下离心20分钟，弃上清，留沉淀。10. 在沉淀中加入200 μl蛋白提取液C，充分混匀。【注】： 提取液C使用前必须保持在2-8℃条件，否则严重影响膜蛋白回收率。11. 在2-8℃条件下振荡30-40分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。【注】： 此步骤必须在2-8℃处理，否则严重影响膜蛋白回收率。 用振荡器/摇床的较低转速，保持液体晃动即可。 没有2-8℃振荡条件也可以不振荡，置2-8℃静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。12. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。13. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴10分钟。14. 在37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为20-30μl。【注】： 此步骤必须在37℃条件下离心。 没有37℃离心条件也可以不离心，稍微延长37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。15. 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。【注】： 上层部分为溶酶体内非膜蛋白的蛋白。 待下游目的膜蛋白实验完成后在丢弃此部分。膜蛋白萃取不完全时此部分蛋白仍可以进行再次提取膜蛋白。16. 用50-100 μl冷的试剂E膜蛋白溶解液溶解下层溶酶体膜蛋白部分，即得溶酶体膜蛋白。【注】： 必须用冷的试剂E溶解膜蛋白。 膜蛋白有时不能马上溶解，产生乳白色现象，此时可以置于2-8℃条件静置后再次轻轻吹打混匀即可。 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀几次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。 于4℃静置直至管底透明粘稠状物完全溶解。17. 将溶酶体膜蛋白样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

1.蛋白浓度低？溶酶体蛋白丰度较低，需要足够的样品量才能得到足够的蛋白，在条件允许的情况下，适当增加细胞或组织样本的上样量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。 用什么方法定量蛋白？建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂C中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。 提取的蛋白具有活性吗？本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。 膜蛋白电泳没有条带？膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。电泳时最好采用低电压低电流电泳。膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。

1.Lujia Feng et al. HMGB1 downregulation in retinal pigment epithelial cells protects against diabetic retinopathy through the autophagy-lysosome pathwayAutophagy 2021 （IF=16.016） 2.Xiaoqin Wei et al. Host RAB11FIP5 protein inhibits the release of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus particles by promoting lysosomal degradation of ORF45PLoS Pathogens 2020 （IF=6.823） Wenmin Deng et al. Disulfiram suppresses NLRP3 inflammasome activation to treat peritoneal and gouty inflammationFree Radical Biology and Medicine 2020 （IF=7.376） Si Chen et al. 27-Hydroxycholesterol Contributes to Lysosomal Membrane Permeabilization-Mediated Pyroptosis in Co-cultured SH-SY5Y Cells and C6 CellsFrontiers in Molecular Neuroscienc 2019 （IF=5.639）