2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

动物细胞/组织

1.使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2.提取过程简单方便。
3.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
4.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
5.总蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP等

1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

使用注意事项：
 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
 蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
 下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。

提取液准备：
每200ul冷的蛋白提取液C中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

细胞溶酶体蛋白提取：
1. 取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；
2. 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 加入500μl-1000ul冷的试剂 A，置冰上振荡10分钟。
4. 用Dounce匀浆器匀浆30-40下。
5. 在4℃，1000×g力条件下离心5分钟，弃沉淀，留上清。
6. 将上清在4℃，4000×g力条件下离心10分钟，弃沉淀，留上清。
7. 将上清在4℃，20000×g力条件下离心20分钟，弃上清，留沉淀。
8. 在沉淀中加入500μl冷的试剂B，混匀。
9. 在4℃，20000×g力条件下离心20分钟，弃上清，留沉淀。
10. 在沉淀中加入100-200ul蛋白提取液C，充分混匀。
11. 轻微振荡15-30分钟。
12. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
13. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到溶酶体总蛋白。
14. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

组织溶酶体蛋白提取：
1. 取50-100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。
2. 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
3. 加入500μl-1000ul冷的试剂 A，置冰上10分钟。
4. 用Dounce匀浆器匀浆30-40下，至无明显可见固体。
5. 在4℃，1000×g力条件下离心5分钟，弃沉淀，留上清。
6. 将上清在4℃，4000×g力条件下离心10分钟，弃沉淀，留上清。
7. 将上清在4℃，20000×g力条件下离心20分钟，弃上清，留沉淀。
8. 在沉淀中加入500μl冷的试剂B，混匀。
9. 在4℃，20000×g力条件下离心20分钟，弃上清，留沉淀。
10. 在沉淀中加入100-200ul蛋白提取液C，充分混匀。
11. 轻微振荡15-30分钟。
12. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
13. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到溶酶体总蛋白。
14. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

1.蛋白浓度低？
溶酶体蛋白丰度较低，需要足够的样品量才能得到足够的蛋白，在条件允许的情况下，适当增加细胞或组织样本的上样量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂C中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

1.Wenmin Deng et al.
Disulfiram suppresses NLRP3 inflammasome activation to treat peritoneal and gouty inflammation
Free Radical Biology and Medicine 2020 （IF=5.657）

2.Si Chen, Cui Zhou, Huiyan Yu, et al.
27-Hydroxycholesterol Contributes to Lysosomal Membrane Permeabilization-Mediated Pyroptosis in Co-cultured SH-SY5Y Cells and C6 Cells
Front Mol Neurosci. 2019; 12: 14. （IF=3.902）