2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB

动物细胞/组织

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1.离心机2.振荡器3.匀浆机/匀浆器4.涡旋混匀器5.移液器6.冰箱7.冰盒

1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）2.蛋白定量试剂盒

1.离心管2.吸头3.一次性手套

1.预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。 2.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 3.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 最好使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，也可用普通玻璃匀浆器匀浆，但是核糖体蛋白回收率会下降。

细胞核糖体蛋白提取：1. 提取液准备：每100 μl冷的核糖体蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。2. 取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；3. 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。4. 加入500 μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。5. 用Dounce匀浆器匀浆充分匀浆，然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。【注】： 先用Dounce匀浆器的松型槌初步匀浆10-20次，再用紧型槌匀浆20-30次。 每上下一个来回为一次。6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。弃沉淀。7. 将上清在4℃，11000×g力条件下离心10分钟。8. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。弃沉淀。9. 将上清在4℃，12000-16000×g力条件下离心10分钟。弃沉淀，留上清。10. 在上清中加入125 μl试剂B，充分混匀。【注】： 试剂B使用前请充分混匀。11. 置2-8℃冰箱静置过夜。【注】： 静置保存时间不少于10小时。12. 在4℃条件下，10000×g离心20-45分钟。13. 小心移除上清，收集沉淀。【注】： 尽可能吸干上清。 吸取时小心，防止吸掉沉淀。14. 沉淀中加入30-50 μl核糖体蛋白提取液C，充分混匀。在4℃条件下振荡10-20分钟。【注】： 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。15. 在4℃，12000×g条件下离心10分钟。16. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核糖体蛋白。17. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。组织核糖体蛋白提取：1. 取50-100 mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。2. 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。 3. 加入500 μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。4. 用Dounce匀浆器充分匀浆30-40下，至无明显固体团块。然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。【注】： 先用Dounce匀浆器的松型槌初步匀浆10-20次，再用紧型槌匀浆20-30次。 每上下一个来回为一次。5. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。弃沉淀。6. 在4℃，11000×g力条件下离心10分钟。7. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。弃沉淀。8. 将上清在4℃，12000-16000×g力条件下离心10分钟。弃沉淀，留上清。9. 在上清中加入125 μl试剂B，充分混匀。【注】： 试剂B使用前请充分混匀。10. 置2-8℃冰箱静置过夜。【注】： 静置保存时间不少于10小时。11. 在4℃条件下，10000×g离心20-45分钟。12. 小心移除上清，收集沉淀。【注】： 尽可能吸干上清。 吸取时小心，防止吸掉沉淀。13. 沉淀中加入30-50 μl核糖体蛋白提取液C，充分混匀。在4℃条件下振荡10-20分钟。【注】： 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。14. 在4℃，12000×g条件下离心10分钟。15. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核糖体蛋白。16. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染

1.蛋白浓度低？ 核糖体蛋白含量较低，在条件允许的情况下，尽可能加大细胞样品的上样量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当增加匀浆次数，延长试剂C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。