2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

动物细胞/组织

WB,IP等

1.离心机2.振荡器3.匀浆机/匀浆器4.涡旋混匀器5.移液器6.冰箱7.冰盒

1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）2.蛋白定量试剂盒

1.离心管2.吸头3.一次性手套

1.预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。 2.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 3.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 4.细胞最好采用新鲜收集的，或者收集后立即置于-80℃保存的样本。 5.最好使用标准Dounce匀浆器匀浆，如果没有标准Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是核糖体回收率可能会下降。

细胞核糖体提取：1. 提取液准备：每100 μl冷的核糖体蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。2. 取1-2×107个细胞，在4℃，500-1000×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞； 3. 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。【注】： 在500×g -1000×g条件下离心5分钟。4. 加入500 μl-1 ml冷的试剂 A，置冰上10分钟。5. 用Dounce匀浆器匀浆20-30下。【注】： 标准Dounce匀浆器用紧杵5-8次，松杵匀浆15-20次。 匀浆杵一个上下来回为一次。 普通玻璃匀浆器匀浆一般也不超过30次，匀浆次数并非越多越好。6. 将匀浆液在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。7. 将上清在4℃，20000×g力条件下离心10分钟，弃沉淀，收集上清。8. 将上清在4℃，100000×g -120000×g力条件下离心60分钟。弃上清，收集沉淀。【注】： 如果条件允许，可将离心时间延长到2-24小时。可以提高核糖体回收率。 液体量较少没有合适转头时，可以将小离心管套入大离心管进行离心；或者用PBS补充液体量后用合适的离心管离心。9. 在沉淀中加入400 μl冷的试剂B，混匀。10. 在4℃，100000×g -120000×g力条件下离心60分钟。【注】： 如果条件允许，可将离心时间延长到2-24小时。可以提高核糖体回收率。 液体量较少没有合适转头时，可以将小离心管套入大离心管进行离心；或者用PBS补充液体量后用合适的离心管离心。11. 弃上清，沉淀用50-100 μl核糖体蛋白提取液C重悬。12. 即得到核糖体蛋白样品，置冰箱-80℃冻存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。组织核糖体提取：1. 提取液准备：每100 μl冷的核糖体蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。2. 取50-100 mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。3. 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。 【注】： 在500×g -1000×g条件下离心5分钟。4. 加入500 μl-1 ml冷的试剂 A，置冰上10分钟。5. 用Dounce匀浆器充分匀浆20-30下，至无明显固体团块。然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。【注】： 标准Dounce匀浆器用紧杵5-8次，松杵匀浆15-20次。 匀浆杵一个上下来回为一次。 普通玻璃匀浆器匀浆一般也不超过30次，匀浆次数并非越多越好。6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。7. 在4℃，20000×g力条件下离心10分钟，弃沉淀，收集上清。8. 将上清在4℃，100000×g -120000×g力条件下离心60分钟。弃上清，收集沉淀。【注】： 如果条件允许，可将离心时间延长到2-24小时。可以提高核糖体回收率。 液体量较少没有合适转头时，可以将小离心管套入大离心管进行离心；或者用PBS补充液体量后用合适的离心管离心。9. 在沉淀中加入400 μl冷的试剂B，混匀。10. 在4℃，100000×g -120000×g力条件下离心60分钟。【注】： 如果条件允许，可将离心时间延长到2-24小时。可以提高核糖体回收率。 液体量较少没有合适转头时，可以将小离心管套入大离心管进行离心；或者用PBS补充液体量后用合适的离心管离心。11. 弃上清，沉淀用50-100 μl核糖体蛋白提取液C重悬。12. 即得到核糖体蛋白样品，置冰箱-80℃冻存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。