2-8℃

1. 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2. 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3. 试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

丝状真菌

1. 离心机
2. 振荡器
3. 匀浆机/匀浆器
4. 涡旋混匀器
5. 移液器
6. 冰箱
7. 冰盒

1. PBS缓冲液
2. 蛋白定量试剂盒

1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套

1. 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
2. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
3. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
4. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
5. 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
6. 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
7. 下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。
8. 如果需要回收所有光面内质网小泡，最后一个离心步骤的离心力需要提高到100000g力。
9. 离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM，r/min）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：
g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如: 转速为3000 rpm，有效离心半径为10 cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。

1. 取200-500 mg新鲜丝状真菌样本，用PBS清洗干净。
2. 加入1-2 ml 提取液A后，用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
3. 在匀浆液中加入1 ml PBS，充分混匀，然后将匀浆液用100 um细胞筛过滤。
4. 将滤液在200×g条件下离心3分钟，弃沉淀，收集上清。
5. 将上清在500×g离心5分钟。弃沉淀，收集上清。
6. 在1000×g条件下离心10分钟，弃沉淀，收集上清。
7. 在3000×g离心10分钟。弃沉淀，收集上清。
8. 将上清11000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
9. 将上清在4℃，50000×g力条件下离心45分钟。弃上清，收集沉淀。
10. 在沉淀中100 μl蛋白提取液B，充分混匀。
11. 在4℃条件下振荡20-30分钟。
12. 在4℃条件下10000×g离心5分钟。弃沉淀，收集上清。
13. 即得到内质网蛋白样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。

1. 蛋白浓度低？
处理部分内质网样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂B的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
真菌内质网蛋白较少，尽可能加大真菌样品的上样量。

2. 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

3. 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

1. Xiyan Zhang et al.
Adsorptive removal of aflatoxin B1 via spore protein from Aspergillus luchuensis YZ-1
Journal of Hazardous Materials 2024 （IF 14.224）

2. Xi Chen et al.
Transcription Factors BbPacC and Bbmsn2 Jointly Regulate Oosporein Production in Beauveria bassiana
Microbiology Spectrum 2022 （IF 9.043）

3. Linjing Shen et al.
Tailoring the expression of Xyr1 leads to efficient production of lignocellulolytic enzymes in Trichoderma reesei for improved saccharification of corncob residues
Biotechnology for Biofuels 2022 （IF 7.670）

4. Wei Luo et al.
Multilevel Regulation of Carotenoid Synthesis by Light and Active Oxygen in Blakeslea trispora
Journal of Agricultural and Food Chemistry 2021 （IF 6.100）

5. Bing Li et al.
SWATH label-free proteomics analyses revealed the roles of oxidative stress and antioxidant defensing system in sclerotia formation of Polyporus umbellatus
Scientific Reports 2017 （IF 5.228）