2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

动物组织

1.使用方便，从组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。 2.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。 3.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。 4.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含7种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP等

1.离心机
2.振荡器
3.匀浆机/匀浆器
4.涡旋混匀器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

1.PBS缓冲液 2.蛋白定量

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
3.蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
4.如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
5.可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
6.Western实验内参可以选用Lamin B、TBP、Histon H3。

1. 提取液制备：
每500 μl冷的蛋白提取液A加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物和1 μl磷酸酶抑制剂。
每200 μl冷的蛋白提取液B中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物和1 μl磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。
【注】：
 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。磷酸酶抑制剂可以一次加入。
 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
2. 取适量组织样本用手术剪刀尽可能剪碎，每20 mg样本中加入200-300 μl冷的提取液 A，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 匀浆液置2-8℃条件振荡10-30分钟。
【注】：
 提取液A处理后细胞体积应减少，否则延长提取液A振荡处理时间。
 如果需要同时收集胞质蛋白，可以稍微减少试剂A的用量，以提高获得的胞质蛋白样品的浓度。
 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
4. 然后在4℃，2000×g力条件下离心5分钟。
5. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
6. 在沉淀中加入50-200 μl冷的蛋白提取液B，高速涡旋振荡15秒。
【注】：
 加提取液B前，必须尽可能吸干提取液A。否则会影响核蛋白纯度。
 也可以用PBS将沉淀洗涤一次。PBS重悬沉淀，12000g离心5分钟。
 提取液B用量根据实验细胞数量情况调整，细胞数量多则多加。也可根据预实验时最终蛋白浓度实际情况调整。
7. 置2-8℃条件振荡30-40分钟，至无明显沉淀。
【注】：
 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
 此步骤蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的蛋白复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，不必进行超声处理。如果引入其他外源性蛋白质不影响下游实验的话，也可以加入DNase处理。
8. 在4℃，12000×g条件下离心10分钟。
9. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
10. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
【注】：
 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。
 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

1.核蛋白浓度低？
核蛋白丰度较低，需要足够细胞数量提取，在条件允许的情况下，尽可能加大细胞量。
注意用蛋白提取液B处理时没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂B的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀，至无明显沉淀。
如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则需要采用超声处理。

2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

1.Pingli Li et al.
Preparation and in vitro immunomodulatory effect of curdlan sulfate
Carbohydrate Polymers 2014 （IF=6.044）

2.Guang Yu, Tonghai Yan et al.
Ser9 phosphorylation causes cytoplasmic detention of I2PP2A/SET in Alzheimer disease
Neurobiology of Aging 2013 （IF=6.189）

3.Wan Li et al.
Anti-inflammatory effects of Morchella esculenta polysaccharide and its derivatives in fine particulate matter-treated NR8383 cells
International Journal of Biological Macromolecules 2019 （IF=4.784）

4.Xiaoling Ma et al.
Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils
PloS one 2012 （IF=4.411）

5.Jinchun Qian et al.
Ophiopogonin D prevents H2O2-induced injury in primary human umbilical vein endothelial cells
Journal of Ethnopharmacology 2010 （IF=3.014）