2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

动物细胞/组织

1.使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2.提取过程简单方便。
3.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
4.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
5.蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP等

1.离心机
2.振荡器
3.匀浆机/匀浆器
4.涡旋混匀器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

使用注意事项：
 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
 蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
 下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。

细胞蛋白提取
1. 提取液准备：
每200 μl蛋白提取液A中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每200 μl蛋白提取液B中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取5-10×106个细胞，在4℃，1000×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每20 μl体积细胞沉淀（约20 mg，2×106个细胞）中加入200-300 μl冷的提取液 A，高速涡旋振荡15秒或吹打混匀，置2-8℃条件振荡15-30分钟。
5. 然后在4℃，1000×g条件下离心10分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞质蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
7. 沉淀用PBS洗涤一次，在4℃，1000×g条件下离心5分钟，弃上清。
8. 在沉淀中加入200 μl冷的提取液B，高速涡旋振荡5秒。
9. 置2-8℃条件振荡30分钟，至沉淀明显减少甚至无明显沉淀。
10. 在4℃，14000×g条件下离心10分钟。
11. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
12. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

组织蛋白提取
1. 提取液制备：
每200 μl蛋白提取液A中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每200 μl蛋白提取液B中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取适量组织样本，用手术剪刀尽可能剪碎，加冷PBS，用组织匀浆机/匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，冰上静置5分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
3. 在4℃，500×g条件下离心5分钟，弃上清。
4. 每20 mg组织（20-30 μl细胞沉淀体积）中加入200 μl冷的提取液 A，高速涡旋振荡15秒或吹打混匀，置2-8℃条件振荡20-30分钟。
5. 然后在4℃，1000×g条件下离心10分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞质蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
7. 沉淀用PBS洗涤一次，在4℃，1000×g条件下离心5分钟，弃上清。
8. 在沉淀中加入100-200 μl冷的提取液B，高速涡旋振荡5秒。
9. 置2-8℃条件振荡30-40分钟，至沉淀明显减少甚至无明显沉淀。
10. 在4℃，12000×g条件下离心10分钟。
11. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
12. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

1.细胞裂解速度慢？
为了充分保证提取得到的蛋白的活性，提取液采用独特的保护蛋白的配方，裂解能力温和，下游应用范围广。
适当延长裂解时间。

2.蛋白浓度低？
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A和试剂B的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

3.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

1.Pingli Li, et al.
Preparation and in vitro immunomodulatory effect of curdlan sulfate
Carbohydrate Polymers 2014 （IF=6.044）

2.Guang Yu, Tonghai Yan et al.
Ser9 phosphorylation causes cytoplasmic detention of I2PP2A/SET in Alzheimer disease
Neurobiology of Aging 2013 （IF=6.189）

3.Wan Li, et al.
Anti-inflammatory effects of Morchella esculenta polysaccharide and its derivatives in fine particulate matter-treated NR8383 cells
International Journal of Biological Macromolecules 2019 （IF=4.784）

4.Mengjuan Wu, et al.
Phosphorylation of SET mediates apoptosis via P53 hyperactivation and NM23-H1 nuclear import
Neurobiology of Aging 2018 （IF=5.117）

5.Xiaoling Ma, et al.
Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils
PloS one 2012 （IF=4.411）

6.Jinchun Qian, et al.
Ophiopogonin D prevents H2O2-induced injury in primary human umbilical vein endothelial cells
Journal of Ethnopharmacology 2010 （IF=3.014）