2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

动物细胞/组织

本试剂盒纯化柱参数：
特点：基团脱落少，结合特异性强
配基密度：20μmol/ml
吸附载量：1mg Con A /柱
最大流速：300cm/h
pH范围：3-10，在位清洗时pH范围可到2-13
使用温度：4℃~常温
保存温度：+4~8℃

WB,IP等

1.离心机
2.振荡器
3.匀浆机/匀浆器
4.涡旋混匀器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

使用注意事项：
 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
 蛋白样品中不可含Tris。
 蛋白样品不可以含有三乙醇胺类的物质。
 蛋白样品中可以含有二价阳离子、非离子表面活性剂。
 上样蛋白样品pH值必须高于8，最好在8-9，蛋白浓度在0.25-0.5mg/ml。
 洗涤细胞和组织是不能用Tris缓冲液。
 每个新柱的最大载量约为1mg糖蛋白，使用过的柱子经过再生反复使用的，载量会有下降。
 用蛋白柱进行糖蛋白富集，需要离心操作时可以将蛋白柱置于一个50ml离心管离心即可。
 最终蛋白样品用于2D电泳前需脱盐。

一、蛋白样品的准备：
以下为由细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤。
其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25-0.5mg/ml后直接上样即可，确保蛋白样品的pH值高于8，并且蛋白样品中不含Tris和高浓度糖。
可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。

细胞裂解：
1. 提取液制备：
每500μl冷的裂解液中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取5-10×106个细胞，在4℃，1000g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷生理盐水洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每5×106个细胞或100mg组织样本中加入500μl冷的蛋白裂解液，混匀后，用匀浆器充分匀浆，至无明显肉眼可见固体。
5. 将匀浆液在4℃条件下振荡15-30分钟。
6. 在4℃，14000g条件下离心15分钟。
7. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。

二、柱平衡：
加入500μl洗柱液洗柱，重力作用下或4℃下500×g力离心1分钟甩干吸附柱。
再次加入500μl洗柱液洗柱，重力作用下或4℃下500×g力离心1分钟甩干吸附柱。

三、上样：
将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱，重力作用下或4℃下500×g力离心1分钟甩干吸附柱。

四、洗柱：
加入300μl洗涤液洗柱，重力作用下或4℃下500×g力离心1分钟甩干吸附柱。
重复两次。

五、洗脱：
加入300μl糖蛋白洗脱液，重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱，收集洗脱液。
再次加入300μl糖蛋白洗脱液，重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱，收集洗脱液，合并两次的洗脱液，即得到糖蛋白。

六、柱保存和柱再生：
载量大幅降低后，需要再生使用的柱子，可以用1ml 0.1M Tris-HCl（pH5.0）缓冲液洗柱，然后用300μl 0.5M NaOH含2M NaCl流洗，最后用500μl 20%乙醇洗即可。然后在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2-8℃保存。

再生使用时，加入500μl pH8.5磷酸盐缓冲液，浸泡蛋白柱填料30分钟，然后用2ml pH8.5磷酸盐缓冲液洗柱即可。

1.柱压升高，液体不流穿或较难离心下来？
柱床被压缩或柱使用时间过长或样品固体杂质较多。
注意上样样品要在16000×g离心15分钟，有条件可以用0.45um膜过滤后再上样，不能将固体杂质上入蛋白柱。
使用次数过多后要更换蛋白柱。