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产品概述
product description
贝博® BBproExtra® 磷酸化蛋白提取试剂盒适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织中提取磷酸化蛋白。 提取过程简单方便，可在1小时内完成。 本试剂盒含有的独特配方能充分保护磷酸化蛋白的磷酸化，够溶解细胞膜包括细胞质膜和核膜。 本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。 本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。 本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。 本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
保存温度
2-8℃
注意事项
1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
一年
检测方法
WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等
适用样本
动物细胞/组织
产品特点
1.使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2.提取过程简单方便，将蛋白提取的时间缩短至30分钟-1小时。
3.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
4.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
5.蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
2.提取过程简单方便，将蛋白提取的时间缩短至30分钟-1小时。
3.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
4.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
5.蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
产品应用
WB,IP等
仪器准备
1.离心机
2.振荡器
3.匀浆机/匀浆器
4.涡旋混匀器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒
2.振荡器
3.匀浆机/匀浆器
4.涡旋混匀器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒
试剂准备
1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒
2.蛋白定量试剂盒
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
2.吸头
3.一次性手套
使用注意事项
使用注意事项：
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
不论是细胞或组织样本，应充分保证蛋白样本的新鲜。组织离体后应当立即放到液氮中保存，长期保存的话最好也在液氮中（如果无液氮条件则放置-80℃）。
电泳buffer中也可加入Na3VO4。
本提取配方中含有蛋白激酶及磷酸酶这两种酶的抑制剂，因此不能用于蛋白激酶和磷酸酶这两种酶的免疫共沉淀实验。
避免蛋白的反复冻融。
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
不论是细胞或组织样本，应充分保证蛋白样本的新鲜。组织离体后应当立即放到液氮中保存，长期保存的话最好也在液氮中（如果无液氮条件则放置-80℃）。
电泳buffer中也可加入Na3VO4。
本提取配方中含有蛋白激酶及磷酸酶这两种酶的抑制剂，因此不能用于蛋白激酶和磷酸酶这两种酶的免疫共沉淀实验。
避免蛋白的反复冻融。
使用方法
细胞磷酸化蛋白提取：
1. 提取液制备：
每500 μl冷的蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取5-10×106个细胞，在4℃，2500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每5×106个细胞中加入500 μl冷的蛋白提取液，混匀后，在4℃条件下振荡15-30分钟。
5. 在4℃，14000×g条件下离心15分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到磷酸化蛋白。
7. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
组织磷酸化蛋白提取：
1. 提取液制备：
每500 μl冷的蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取100 mg组织样本剪碎，加入蛋白提取液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃条件下振荡10-20分钟。
4. 在4℃，12000-14000×g条件下离心10分钟。
5. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到磷酸化蛋白。
6. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
常见问题分析
1.蛋白浓度低？
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
参考文献
1.Yu Liu, et al.
HIV-1 Protein Tat1–72 Impairs Neuronal Dendrites via Activation of PP1 and Regulation of the CREB/BDNF Pathway
Virologica Sinica 2018
2.Yan Li, et al.
Over-expression of ARHGAP18 suppressed cell proliferation, migration, invasion, and tumor growth in gastric cancer by restraining over-activation of MAPK signaling pathways
OncoTargets and Therapy 2018
HIV-1 Protein Tat1–72 Impairs Neuronal Dendrites via Activation of PP1 and Regulation of the CREB/BDNF Pathway
Virologica Sinica 2018
2.Yan Li, et al.
Over-expression of ARHGAP18 suppressed cell proliferation, migration, invasion, and tumor growth in gastric cancer by restraining over-activation of MAPK signaling pathways
OncoTargets and Therapy 2018
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