2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等

动物细胞

1.使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2.将蛋白提取的时间缩短至1小时。
3.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
4.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
5.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等

1.离心机
2.振荡器
3.匀浆机/匀浆器
4.涡旋混匀器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

使用注意事项：
 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
 提取液B在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
 膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。

1. 提取液制备：
每400 μl冷的蛋白提取液A/B/D中都分别加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物和2 μl磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取5-10×106个细胞，在4℃，800×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每5×106个细胞中加入400 μl冷的蛋白提取液A，混匀后，在4℃条件下用试剂盒所配针筒反复吸吹细胞，使细胞完全破裂。
5. 在4℃，1000×g条件下离心5分钟。
6. 将上清（I）吸入另一干净离心管，在沉淀中加入100-200 μl冷的提取液B，高速涡旋振荡15秒，充分混匀。
7. 将混匀的提取液B置4℃低速振荡30-60分钟。
8. 将提取液B在37℃条件下水浴10分钟。
9. 将提取液B在37℃下1000×g -2000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），上层为核内蛋白，下层是核膜蛋白约为20-40 μl。小心移除上层，用1-2倍体积的冰冷的提取液D溶解下层即为细胞核膜蛋白。
10. 在步骤6中所得到的上清（I）中加入5 μl提取液C，充分混匀。
11. 在2-8℃振荡20-30分钟。
12. 在37℃水浴10分钟。
13. 在37℃下 1000×g离心3分钟，此时溶液分为两层，上层是胞浆蛋白部分，下层部分（II）是细胞膜蛋白约为40-50 μl。
14. 将上层小心吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白。
15. 用50-150 μl冰冷的提取液D溶解步骤13中的下层部分（II），即得细胞膜蛋白。
16. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

1.蛋白浓度低？
处理部分样本时可能没有裂解完全，导致核蛋白/膜蛋白浓度低。只要适当延长试剂BC的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
膜蛋白丰度较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大细胞的上样量。

2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

1.Manying Wang, et al.
20(S)-ginsenoside Rg3 promotes myoblast differentiation and protects against myotube atrophy via regulation of the Akt/mTOR/FoxO3 pathway
Biochemical Pharmacology 2020

2.GuoDe Wu, et al.
microRNA-592 blockade inhibits oxidative stress injury in Alzheimer's disease astrocytes via the KIAA0319-mediated Keap1/Nrf2/ARE signaling pathway
Experimental Neurology 2020

3.YuyaoXiang, et al.
2,3,5,6-Tetramethylpyrazine improves diet-induced whole-body insulin resistance via suppressing white adipose tissue lipolysis in mice
Biochemical and Biophysical Research Communications 2020

4.Yi Yan, et al.
Transcriptional regulation of microRNA-126a by farnesoid X receptor in vitro and in vivo
Biotechnology Letters 2020

5.Meng Wang, et al.
trans-Cinnamaldehyde Reverses Depressive-Like Behaviors in Chronic Unpredictable Mild Stress Rats by Inhibiting NF-κB/NLRP3 Inflammasome Pathway
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2020